1 实验部分

1. 1 仪器与试剂

Waters 液相色谱仪- UV 481 检测器, N2000 色谱工作站; 旋转蒸发仪; UV三用紫外分析仪 。精制大豆磷脂 ; 银杏提取物, 其中银杏总黄酮含量不少于24% , 银杏内酯含量大于6% , 银杏酸含量小于10 - 6( w) ; 槲皮素、山柰素、异鼠李素、白果内酯B、银杏内酯A、银杏内酯B 标准品(供含量测定用) 均购于中国药品生物制品检定所; 甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇等试剂均为分析纯, 实验用水均为二次蒸馏水。

1. 2 银杏磷脂复合物制备

将一定量的银杏提取物与磷脂在一定条件下反应后, 减压除去反应溶剂; 然后再加入适量二氯甲烷, 充分溶解其中的磷脂及复合物; 过滤, 收集滤液, 减压蒸馏将二氯甲烷蒸干, 收集固体, 为黄褐色粉末。用以下方法测定黄酮的复合率。

1. 3 银杏磷脂复合物中黄酮复合率的测定

1. 3. 1 色谱条件

依据2000 版药典一部 银杏叶下黄酮含量测定的方法。Waters C18 柱(300mm×4. 5mm, 4. 5μm) ; 流动相: 甲醇- 0. 5 %磷酸水溶液(体积比50 ∶50) ; 流速1. 0 mL/ min ; 检测波长365 nm;进样量为10μL。

1. 3. 2 标准溶液的制备

精密称取在110 ℃干燥2 h 的槲皮素6. 0 mg , 山柰素3. 4 mg , 异鼠李素2. 1mg , 置同一50 mL 容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 作为对照品溶液。

1. 3. 3 银杏叶提取物样品溶液的制备

精密称取银杏叶提取物50 mg , 加甲醇- 25%盐酸(体积比4 ∶1)混合液5 mL , 回流30 min , 放冷, 转移至50 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度, 摇匀即得。

1. 3. 4 银杏磷脂复合物样品溶液的制备

称取75 mg 的复合物, 同上法制备样品溶液。

1. 3. 5 产品中黄酮复合率的测定

测得银杏磷脂复合物中总黄酮醇苷的质量分数( w) , 按下式计算黄酮复合率: 

式中w 表示质量分数(下同) , 总黄酮醇苷质量分数由下式得到:

w(总黄酮醇苷) = [ w(槲皮素) + w(山柰素) + w(异鼠李素) ] ×2. 51

2 结果与讨论

2. 1 分析方法的选择

如用紫外分光光度法测量银杏中黄酮成分时加入AlCl3 等作为显色剂, 但磷脂也与显色剂作用, 在银杏黄酮的zui大吸收波长360 nm处也有强吸收, 引起干扰。用药典所载HPLC方法, 复合物在酸性条件下水解, 磷脂阴性对照在360 nm处没有吸收, 无干扰, 因而可依该法测定复合物中银杏总黄酮醇苷的含量, 见图1。

2. 2 标准曲线的绘制

分别精密吸取标准溶液3、5、6、8、10、15、20μL , 按照上述色谱条件进样分析。槲皮素( Y1) 、山柰素(Y2) 、异鼠李素( Y3) 的含量(mg/ mL) 与峰面积( X1、X2、X3) 的线性回归方程为Y1 = 1. 383 ×10 - 7 X1 + 0. 037 , r1 = 0. 999 7 ;Y2 = 1. 264 ×10 - 7 X2 + 0. 029 , r2 = 0. 999 5 ; Y3 =1. 377 ×10 - 7 X3 + 0. 017 , r3 = 0. 999 6。

2. 3 回收率及精密度测定

精密称取5 份已知总黄酮醇苷含量的银杏磷脂复合物, 每份60 mg 分别加入槲皮素4 mg、山柰素2 mg、异鼠李素1 mg , 按1. 3. 4 方法制备样品,测得总黄酮醇苷的加样回收率为96% , RSD 为1. 9 %。取银杏磷脂复合物的样品5 份, 每份约80 mg , 精密称定, 分别按方法制得供试品溶液, 测定总黄酮醇苷含量的RSD 为2. 1 %( n = 5) 。

2. 4 稳定性试验

取槲皮素0. 08 mg/ mL、山柰素0. 04 mg/ mL、异鼠李素0. 02 mg/ mL 的对照品溶液在配制的当天以及后两天的不同时间进样测定, 测得总黄酮醇苷含量的RSD 为2. 8% , 表明对照品至少在3 d 内稳定。

2. 5 阴性对照实验

精密称取银杏叶提取物的阴性样品90 mg , 按照方法1. 3. 4 制得阴性对照液, 进样测定, 在3 个对照品出峰的位置不出现干扰测定的色谱峰。

2. 6 复合物制备方法的优化

以表1 的3 因素3 个水平进行正交设计试验, 做L9(34) 表, 以1. 3. 5 中黄酮复合率为评价指标。根据极差分析得到, RB > RA > RC , 影响因素大小顺序为B > A > C。其中溶剂因素是影响黄酮转换率的重要因素, 银杏磷脂复合物*制备条件为A3B2C3 , 即银杏与磷脂的配比为1 ∶2 , 四氢呋喃为溶剂, 反应时间为20 h。从试验结果可以看到, 以介电常数较小的四氢呋喃和二氯甲烷- 甲醇(体积比6 ∶1) 为反应溶剂时, 复合率较高。而以介电常数较大的甲醇为反应溶剂时药物的复合率较低, 是因为在非质子溶剂中进行反应, 有利于反应物间的相互作用。随磷脂的比例提高, 复合率呈增长趋势。主要因为磷脂对药物可能具有一定的增溶作用 , 且两类物质之间的键合作用有一定的配比度, 2 ∶1 的比例有利于二者充分地相互作用。

2. 7 复合物中银杏内酯的检查

银杏内酯是银杏提取物中重要的活性成分,对银杏磷脂复合物的药用活性有重要的决定意义。 取质量比为1 ∶2 ∶3 的银杏提取物、磷脂阴性对照和银杏磷脂复合物进行薄层层析, 结果如图2。可见在复合物中依然有白果内酯B、银杏内酯A、B 的存在, 磷脂无干扰。虽没有购得银杏内酯C 的标准品, 但与文献[ 15]图谱比较, 也可推知有银杏内酯C的存在。

2. 8 复合率的测定

经1. 3. 3 测试银杏叶提取物的总黄酮含量为25. 40 %( n = 3) 。在*工艺条件下, 重复3 次实验, 黄酮复合率均高于98%。复合物中黄酮醇苷含量可达8. 30 %。