本文构建了液相色谱法同时检测咖啡豆中6种主要的酚酸类化合物:咖啡酸(caffeicacid)、3-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquin-icacid，3-CQA)、4-咖 啡 酰 奎 尼 酸(4-O-caf-feoylquinicacid，4-CQA)、5-咖 啡 酰 奎 尼 酸(5-O-caffeoylquinicacid，5-CQA)、3，5-二咖啡酰奎尼酸(3，5-O-dicaffeoylquinicacid，3，5-diCQA)、4，5-二咖啡酰奎 尼 酸(4，5-O-dicaffeoylquinicacid，4，5-diCQA) ，对我国咖啡豆原料及其制品的质量控制、资源合理开发利用具有重要的指导意义。

1实验部分

1．1仪器、试剂与材料

液相色谱仪LCsolu-tion色谱数据工作站;梅特勒电 子 天 平(1/10000) ;超声波清洗器;纯 水 机。

5-CQA、咖啡酸对照品，3-CQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA对照品，4-CQA对照品，所有对照品纯度均大于或等于98%;乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;水为超纯水。咖啡豆样品于2009年10月收集于云南丽江、德宏、保山、思茅4个产区各种植园(样品粉碎过20目筛，室温避光保存)。

1．2色谱条件

色谱柱:KromasilC18柱(200mm×4.6mm，5μm) ;柱 温25°C;进 样 量:10μL;流 动 相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)、乙腈(B)。洗脱程序:0～42min，5%B～25%B;43～46min，25%B;47～50min，25%B～50%B;51～52min，50%B;53～55min，50%B～5%B;56～60min，5%B。流速:1.0mL/min;检测波长:325nm。

1．3对照品贮备液的制备

精密称取咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA对照品适量，分别置于25mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到各对 照 品 贮 备 液。其质量浓度依次为:103.20、337.68、208.15、447.90、166.67和206.15mg/L。再分别吸取咖啡酸0.01mL、3-CQA0.05mL、4-CQA0.05mL、5-CQA0.1mL、3，5-diCQA0.05mL、4，5-diCQA0.04mL充分混匀，得混合对照品贮备液，各组分相应质量浓度依次为:3.44mg/L、56.28mg/L、34.69mg/L、149.30mg/L、27.79mg/L和27.49mg/L。

1．4供试品溶液的制备

精密称取0.25g咖啡豆碎末，置于100mL锥形烧瓶中，加入70%甲醇25mL，室温下超声提取30min，过滤冷却定容于50mL容量瓶中，过0.45μm微孔滤膜，即为供试品溶液。

2结果与讨论

2．1样品前处理方法的优化

2．1．1提取溶剂的考察

实验分别比较了同等处理条件下，水、50%甲醇、70%甲醇对绿咖啡豆中酚酸类物质的提取效果。结果显示50%甲醇提取物中酚酸类物质的含量为4.36%，明显高于水提物的3.26%，而70%甲 醇 比50%甲醇提取物中酚酸类物质的含量高0.20%。为了使样品中的目标物尽可能地*提取出来，本实验zui后选用70%甲醇作为提取溶剂。

2．1．2提取方法的考察

比较了同等处理条件下70%甲醇超声法和回流法两者的提取效果。经测定，超声法与回流法提取物中酚酸类化合物的含量分别为4.54%和4.21%，前者略高于后者且超声提取法操作简便、快速。此外，文献报道绿原酸类化合物具有热不稳定性［2］，选择在室温下超声提取更利于减少有效成分的损失。

2．1．3提取次数及时间的考察

比较了同等处理条件下70%甲醇超声提取一次(30min)和超声提取两次(30min+15min)两者的提取效果，结果表明超声30min能够*提取出咖啡豆中的酚酸类物质。

2．2线性关系及检出限

精密量取1.3节所述混合对照品贮备液，逐级稀释配制成不同浓度的混合对照品工作液，分别进样20μL，记 录 峰 面 积。以 各 对 照 品 质 量 浓 度(mg/L)X为横坐标，其峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得到6种酚酸类物质的线性范围、线性回归方程及相关系数。以仪器信噪比(S/N)确定6种化合物的zui低检出限(LOD，S/N=3) ，见表1。

2．3精密度试验

取1.3节所述混合对照品贮备液，在上述色谱条件下进样10μL，重复进样6次，测定峰面积。咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA、4，5-diC-QA峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.90%、0.85%、0.94%、0.81%、1.08%和0.83%。

2．4重复性试验

精密称取咖啡豆碎末(云南丽江)共6份，按1.4节方法制备供试液，在1.2节色谱条件下进样10μL，测得咖啡酸的平均含量为0.46mg/L，RSD为0.75%;3-CQA的平均含量为11.14mg/L，RSD为1.51%;4-CQA的平均含量为15.72mg/L，RSD为1.80%;5-CQA的 平 均含 量 为139.18mg/L，RSD为2.08%;3，5-diCQA的 平 均 含 量 为13.96mg/L，RSD为1.29%;4，5-diCQA的 平 均 含 量 为13.79mg/L，RSD为1.45%。

2．5稳定性试验

取同一供试样品提取液，在室温中放置，分别在0、2、4、6、8、12h进样分析，记录色谱图，测定峰面积。咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA峰 面 积的RSD分 别 为2.0%、1.6%、1.9%、1.2%、1.9%和2.2%。结果表明6种化合物溶液在12h内稳定。

2．6加样回收率试验

取0.25g已知6种酚酸含量的云南丽江咖啡豆样品9份，分别加入混合对照品溶液(混合对照品溶液按1．3节所配制各对照品贮备液等量混匀制备，各组分质量浓度为:3-CQA56.28mg/L、5-CQA74.65mg/L、4-CQA34.69mg/L、咖 啡 酸17.20mg/L、3，5-diCQA27.78mg/L、4，5-diCQA34.36mg/L)1、2、3mL，每组3份，按1.4节方法制备供试液进样分析，计算各组分的加标回收率(见表2)。

2．7样品含量测定

采用上述建立的分析方法，测定了云南德宏、思茅、保山及丽江4个产地的绿咖啡豆中6种酚酸类化合物的含量(见表3)。样品检测前均置于烘箱中同等温度、时间(60°C，1h)烘干处理，以保证各样品中水分含量基本一致。6种酚酸类化合物混合标准溶液和咖啡豆样品的色谱图见图2。样品检测情况显示，不同产地的咖啡豆中6种酚酸类化合物的含量差异明显，其主要原因可能是由于原料品种、产地土壤栽培及气候条件的不同，同时，也与原料采收时期及采后加工工艺有着密切关系。另外，云南4个产区的样品中3-CQA、4-CQA、5-CQA的含量普遍偏高，保山咖啡豆中的5-CQA的含量尤为显著，这为深入开发云南咖啡豆资源，尤其是保山潞江坝产区原料提供了重要参考。

3结论

绿原酸类化合物的分子结构中有酯键、不饱和双键及多个酚羟基，其水溶液在中性和碱性环境下稳定性较差，本实验选用0.1%甲酸和乙腈作为流动相，抑制羧基和酚羟基电离，并针对咖啡豆中主要的酚酸类化合物特性对梯度洗脱程序作了相应的调整，建立了同时测定咖啡豆中6种酚酸类化合物的液相色谱方法。该法简便、快速、灵敏度高，适用于咖啡豆中6种酚酸类化合物的同时分析以及咖啡豆原料与制品的质量控制和综合评价。在本文研究基础上，就如何有效提高绿咖啡豆中酚酸类化合物等多种营养物质的含量及生物利用度，促进我国咖啡豆资源的深度综合开发，加强产品在世界范围的竞争力，本课题组将进行更为系统的植物资源与化学研究。