二硝托胺因其毒性小，防治球虫效果好而得到普遍应用，但长期高浓度使用会造成药物残留，对人体健康造 成 潜 在 危 害我 国 农 业 部235号公告中规定二硝托胺的zui大残留*以亲体和代谢产物(3-Amino-5-nitro-o-toluamide，ANOT)总量计，鸡肉和鸡肝中分别为3000和6000!g/kg目前尚缺乏相应的残留分析物标准方法，因此有必要开展测定鸡组织中二硝托胺和ANOT残留量的分析方法研究。

实验部分

2．1仪器与试剂

Waters超液 相 色 谱 仪(美 国Waters公 司) ，配二极管阵列检测器;AcquityBHEC18色 谱 柱(100mm×2．1mm，1．7!m) ;固相萃取仪(美国Supelco公司) ;HLB小柱(3mL，60mg，Waters公司) ;Sigma离心机;Ultra-TyrraxT25型匀质器(德国)。

二硝托胺和ANOT标准品(Dr．Ehrenstorfer公司) ;甲醇和乙腈(色谱纯，Merck公司) ;甲酸(色谱纯，Tedia公司) ;KH2PO4和K2HPO4·3HO2(分析纯，上海化学试剂公司) ;磷酸盐缓冲液(pH6．0和4．0)。

2．2色谱分离条件

流动相:A为0．1%甲酸，B为乙腈。梯度洗脱:0～1．0min，80%A;1．0～4．0min，80%～30%A;4．0～5．0min，30%A;5．0～5．1min，30%～80%A;5．1～7．0min，80%A。流速0．2mL/min，进样量10!L，检测波长317nm;柱温30°C。

2．3样品处理

准确称取2g试料于50mL离心管中，在鸡肉和鸡肝中分别加入pH7．0和pH4．0的磷酸盐缓冲液10mL，以10000r/min速度匀质1min，再以8000r/min离心5min，收集上清液;在残渣中再加入10mL磷酸盐缓冲液，同样步骤操作后合并上清液;取4mL上清液调至pH7．0，再以8000r/min离心5min，上清液加入到已经被3mL甲醇和3mL水活化的HLB小柱中，待净化液液面到达柱吸附层表面时加入3mL水淋洗，抽干柱子，用4mL0．1%甲酸-乙腈(80∶20，V/V)洗脱，收集洗脱液，过0．22!m滤膜，供LC分析。

3结果与讨论

3．1色谱条件的建立

在210～800nm范围内对二硝托胺和ANOT的标准溶液进行扫描(图1) ，二硝托胺存在两个zui大图1二硝托胺(a)和ANOT(b)光谱分别在216．0和300．8nm;而ANOT至少存在两个zui大吸收峰，分别为317．4和526．9nm。考虑到ANOT的灵敏度低于二硝托胺，为尽量提高ANOT的灵敏度，避免干扰峰，本实验选择317nm进行分析。

采用梯度洗脱对二硝托胺和ANOT进行同时分析时，初始流动相中有机相比例大于25%时，ANOT和二硝托胺出峰太快，易受杂质干扰;而有机相比例低于15%时，ANOT由于出峰较迟而易受杂质干扰。本实验将初始流动相中水相和有机相的比例定为8∶2。从图2可 知，二硝 托 胺 和ANOT的 峰 形 均 较好，在空白组织中未见干扰。

3．2提取和净化条件的选择

二硝托胺和ANOT极性较强，且易溶于酸性溶液，本实验采用磷酸盐缓冲液pH(4，5，6和7)提取鸡肌肉和鸡肝样品(图3)。当pH=6．0时，肌肉样品中二硝托胺和ANOT的提取回收率均高于90%;于肝脏样品，pH=4．0～7．0时，提取效果越来越差，仅pH4．0时，二硝托胺和ANOT的提取回收率高于90%。因此，提取样品时，肌肉和肝脏样品分别采用pH6．0和pH4．0的磷酸盐缓冲液。

而对实验发现，鸡肉提取液直接进行固相萃取净化时，ANOT的回收率仅约40%，且HLB小柱换成BondElutC18小柱后，回收率无明显改善。而鸡肉提取液调至pH7．0后进行实验，过HLB小柱，回收率大于90%;过BondElutC18柱，回收率无明显改善。本实验采用HLB小柱进行净化。

3．3线性实验

称取二硝托胺和ANOT标准品各10．0mg于100mL容量瓶中，用乙腈定容，得100mg/L的标准储备液。用0．1%甲酸-乙腈(80∶20，V/V)稀释，配制20，100，200，500，1000和2000!g/L系列标准工作液，进行LC分析，每个浓度进样3次，以标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。实验结果表明，二硝托胺和ANOT的线性范围为20～2000!g/L，标准曲线方程分别为y=206．6x－1049．7(ANOT)和y=211．5x－1787．8(二硝托胺) ，相关系数(r)均高于0．9998。本方法适用于二硝托胺和ANOT的定量分析。

3．4方法的检出限、回收率和精密度

采用在空白样品中添加标准溶液的方法，对鸡肉和鸡肝样品进行了3次添加回收实验，每个浓度点重复进 行6次，结 果 见 表1。鸡肉和鸡肝中各浓度点二硝托胺和ANOT的平均添加回收率均在79．2%～88．1%之间。批内相对标准偏差(RSD)均在2．7%～5．2%之间，批间RSD均在4．1%～6．9%之间，方法具有较好的准确性和稳定性。同时按信噪比S/N=3∶1计算得两种组织中的检出限为55．0!g/kg(ANOT)和25．0!g/kg(二硝托胺)。